蛋白質保存全知道：穩(wěn)定蛋白質活性的科學指南
蛋白質在生物體內扮演著極為重要的角色，它們參與細胞的構建、催化化學反應、傳遞信號等多種生理過程。在實驗室研究、生物技術應用以及生物制藥等領域，蛋白質也是關鍵的研究對象和生產(chǎn)原料。然而，蛋白質在制備、保存和使用過程中卻面臨著諸多挑戰(zhàn)，如容易出現(xiàn)聚集、沉淀和變性等問題，這些問題會嚴重影響蛋白質的活性與功能，進而影響相關研究和應用的準確性與有效性。
一、影響蛋白質穩(wěn)定性的因素
（一）劇烈刺激
蛋白質對環(huán)境變化較為敏感，pH 值的大幅波動、溫度的急劇升降、反復凍融循環(huán)、攪拌以及過濾等操作都可能成為破壞蛋白質穩(wěn)定性的 “元兇"。攪拌會使蛋白質暴露于空氣 - 水界面，過濾則讓其處于液體 - 固體界面，而 pH 值與溫度的劇烈變化更是直接干擾蛋白質分子內部的化學鍵，這些因素綜合起來極有可能導致蛋白質空間結構發(fā)生改變，使其原本有序的結構變得松散無序，最終形成沉淀而失去活性。
（二）氨基酸側鏈變化
蛋白質中的某些氨基酸側鏈容易發(fā)生化學反應，進而影響蛋白質的整體穩(wěn)定性。像甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基具有較高的氧化敏感性，一旦被氧化，蛋白質的結構和功能便會受到損害。此外，天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用以及肽主鏈肽基團的切割也較為常見，這些變化會改變蛋白質的化學組成和結構，最終導致蛋白質功能的改變甚至喪失。
二、蛋白質的保存原則
（一）減少蛋白酶影響
蛋白酶猶如一把 “剪刀"，能夠催化蛋白質和多肽的水解反應，將它們切割成更小的片段。由于蛋白酶廣泛存在于各種環(huán)境中，在蛋白質制備的初始階段就必須考慮如何降低其對目標蛋白質的破壞作用。可以選用蛋白酶缺陷的菌株來生產(chǎn)蛋白質，從源頭上減少蛋白酶的含量；在破菌純化蛋白的第一步就及時加入蛋白酶抑制劑，抑制胞內蛋白酶的活性；同時，使用經(jīng)過嚴格滅菌處理且無雜質污染的槍頭、緩沖液等耗材，避免其他微生物來源的蛋白酶混入樣品中。值得一提的是，如果目的蛋白以包涵體形式存在，由于其特殊的結構，能夠在一定程度上抵御蛋白酶的攻擊，降低被破壞的風險。
（二）低溫保存
低溫環(huán)境對于蛋白質來說就像是一個 “保護罩"。低溫能夠顯著降低蛋白質分子的熱運動，減少分子內部化學鍵斷裂的可能性。同時，低溫還能抑制微生物的生長繁殖，降低蛋白酶的活性，從而為蛋白質的保存創(chuàng)造有利條件。對于短期保存（1 周以內），通常將蛋白質置于 4°C 的環(huán)境中較為適宜；而對于長期保存（數(shù)月至數(shù)年），則需要更低的溫度，如 -20°C 或 -80°C。不過需要注意的是，-20°C 冰箱在實際使用過程中，由于頻繁開關門，尤其是靠近冰箱門的區(qū)域，溫度波動較大，很難穩(wěn)定維持在 -20°C，甚至在無霜冰箱中還可能出現(xiàn)反復凍融現(xiàn)象，這對蛋白質的穩(wěn)定性極為不利。此外，-20°C 接近某些鹽的共融點，容易導致晶體反復凍融，進而引發(fā)蛋白質變性。因此，在條件允許的情況下，-80°C 是更為理想的長期保存溫度選擇。
（三）分裝保存
蛋白質在冷凍保存與使用過程中存在一個棘手的問題，那就是反復凍融。每次凍融都會對蛋白質的結構造成一定程度的損傷，導致其活性逐漸喪失或發(fā)生變性。為了減少這種損傷，將純化后的蛋白質進行分裝保存是一種有效的策略。一般建議每管分裝 50 至 100 微升，具體可根據(jù)蛋白質的濃度以及實驗的實際需求進行適當調整，但每管最少不應低于 10 微升。在使用時，僅解凍本次實驗所需的部分，并且盡量控制凍融次數(shù)不超過兩次。對于實驗剩余的蛋白質，如果短期內還會使用，可暫時存放在 4°C 冰箱中，但存放時間不宜超過一周。
（四）控制濃度
蛋白質的濃度過高或過低都會引發(fā)一系列問題。當濃度過高時，蛋白質分子之間的相互作用增強，容易發(fā)生聚集并沉淀下來；而當濃度過低（低于 0.1mg/mL）時，蛋白質又會特異性地吸附在管壁上，造成蛋白質的損失，從而影響后續(xù)實驗的準確性和可重復性。因此，在保存蛋白質時，需要將其濃度控制在一個合適的范圍內，一般建議濃度為 1 - 10mg/mL。
（五）速凍與速融
緩慢的冷凍過程會使蛋白質處于一種極為 “惡劣" 的環(huán)境中，可能會使其暴露在高鹽濃度高 pH 條件下，這種環(huán)境會嚴重破壞蛋白質的活性。因此，在冷凍蛋白質時，應采用快速冷凍的方法，如使用液氮或干冰 / 乙醇 / 丙酮混合物進行速凍，讓蛋白質能夠迅速越過危險的溫度區(qū)間，減少損傷。同樣，在解凍時也需要讓蛋白質快速恢復到適宜的鹽濃度和 pH 條件下，例如可以像復蘇細胞一樣，將蛋白質樣品置于 37°C 的溫水中快速解凍。
（六）合理使用添加劑
在蛋白質保存過程中，添加劑的使用需要謹慎選擇，必須確保所添加的試劑不會對蛋白質的活性產(chǎn)生負面影響。
緩沖液：緩沖液能夠維持溶液的 pH 值穩(wěn)定，一般選擇 pH 在中性范圍內（如 50 mmol/L pH8.0 的 Tris - HCl 或 PBS），鹽濃度在 0 - 150mmol/L 的緩沖液較為合適。合適的緩沖液可以為蛋白質提供一個相對穩(wěn)定的化學環(huán)境，減少 pH 值波動對蛋白質穩(wěn)定性的影響。
保護劑：不同的保護劑具有不同的功能。甘油（濃度為 10% - 50%）可以防止蛋白質在冷凍過程中受到損傷，避免因凍融而導致的變性；Na2N2（濃度為 0.02% - 0.1%）能夠有效抑制細菌的生長繁殖，但需要注意的是，Na2N2會干擾某些抗體蛋白參與的氨基反應，在這種情況下，可以使用 0.01% 的硫柳汞來替代；PMSF 作為一種蛋白酶抑制劑，可以防止蛋白酶對蛋白質的降解作用；DTT 則是一種還原劑，能夠防止蛋白質發(fā)生氧化反應。然而，在體內實驗時，由于Na2N2和硫柳汞可能對生物體產(chǎn)生毒性，因此不可添加這兩種物質，通常采用過濾除菌的方法來保證蛋白質溶液的無菌性。
三、蛋白質的保存策略
（一）液體狀態(tài)下不凍結保存
在液體狀態(tài)下短期保存蛋白質時，可以將溫度控制在 2 - 8°C，在這個溫度區(qū)間內，蛋白質能夠保持相對穩(wěn)定，減少聚集沉淀的發(fā)生，但需要注意的是，即使在這個溫度下，蛋白質仍然會發(fā)生緩慢的化學降解反應。為了進一步提高蛋白質的穩(wěn)定性，需要調節(jié)溶液的 pH 值，使其維持在 5.5 - 7.5 的穩(wěn)定范圍內。此外，由于蛋白質具有較強的去折疊傾向，可以添加一些非特異性穩(wěn)定劑，如 0.5M 的蔗糖，它能夠與蛋白質分子相互作用，增加蛋白質的穩(wěn)定性。還可以添加硫酸銨、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖等添加劑，這些添加劑通過優(yōu)先排阻的方法維持蛋白質的熱力學穩(wěn)定性，其中檸檬酸鹽緩沖液（在不存在鈣離子的情況下）效果較為顯著。溶液中離子的電荷屏蔽作用能夠降低蛋白質分子間的電荷 - 電荷排斥作用，但離子濃度的選擇需要根據(jù)具體的實驗進行優(yōu)化調整。
（二）凍結溫度下保存
在選擇凍結溫度保存蛋白質時，-80°C 相較于 -20°C 具有明顯優(yōu)勢。-80°C 能夠更大程度地降低蛋白質的降解速率，為蛋白質提供更好的長期保存條件。而 -20°C 冰箱由于其自身特點，如頻繁開關門導致溫度不穩(wěn)定，特別是在無霜冰箱中易出現(xiàn)反復凍融現(xiàn)象，且接近某些鹽的共融點，容易造成晶體反復凍融，從而引起蛋白質變性。在緩沖液的選擇上，由于低溫下堿性鹽容易結晶，酸性鹽仍可溶解，冷凍時磷酸鹽緩沖液 pH 值會大幅下降，這可能導致許多蛋白質發(fā)生變性。因此，應優(yōu)先選擇檸檬酸鹽、Tris、組氨酸等緩沖液，以減少 pH 值變化對蛋白質的影響。同時，加入甘油、鹽析鹽、二糖（濃度高于 0.3M）、表面活性劑（濃度低至 0.1%）等保護劑，能夠有效防止蛋白質在冷凍過程中發(fā)生變性和沉淀；添加百分之幾的 BSA 或聚合物也可以抑制冷凍引起的蛋白質去折疊；適當增加蛋白質的起始濃度，能夠增強其在凍融過程中對損傷的耐受性。
（三）凍干保存
凍干是一種較為特殊且有效的蛋白質保存方法，它通過將溶劑或懸浮介質在低溫下冷凍，然后使固態(tài)的溶劑直接升華為氣態(tài)，從而去除水分，得到干燥的蛋白質樣品。這種方法能夠很好地保持蛋白質物質骨架的穩(wěn)定性，并且在復融后其結構和功能基本不發(fā)生改變。凍干過程主要包括預凍結、升華干燥和解析干燥三個階段。在凍干過程中，添加必要的穩(wěn)定劑對于防止蛋白質變性至關重要，其中非還原型的海藻糖和蔗糖（濃度為 200 - 300mM）作為穩(wěn)定劑對蛋白質的保護較好。需要注意的是，應避免使用還原型糖，如葡萄糖、麥芽糖、乳糖等，因為它們會引發(fā)美拉德（Maillard）反應，導致蛋白質降解。目前，商業(yè)化的蛋白質凍干產(chǎn)品通常采用添加海藻糖 5%、甘露醇 5%、tween - 80 0.01% 的方法來保護蛋白質。然而，凍干方法也存在一些不足之處，例如凍干設備復雜且昂貴，這使得凍干成本較高；某些蛋白質在凍干后可能無法全復溶，或者在凍干 / 復溶過程中會受到損傷，導致蛋白質活性下降。因此，凍干通常作為蛋白質保存的最后選擇，只有在其他保存方法無法滿足需求時才考慮使用。
四、蛋白質保存的注意事項
（一）SDS - PAGE 檢測
在蛋白質保存過程中，如果發(fā)現(xiàn)蛋白質活性有所下降或丟失，首先應進行 SDS - PAGE 跑膠檢測。SDS - PAGE 是一種常用的蛋白質分析技術，它能夠根據(jù)蛋白質分子的大小將其分離，通過跑膠結果可以直觀地觀察蛋白質是否發(fā)生了降解，從而幫助我們初步判斷蛋白質活性丟失的原因，為后續(xù)采取相應的措施提供依據(jù)。
（二）無菌操作
我們的皮膚表面存在著各種蛋白酶以及其他化學物質，這些物質很容易污染蛋白質樣品，進而影響蛋白質的穩(wěn)定性和活性。因此，在進行蛋白質相關操作時，務必戴上手套，避免皮膚直接接觸蛋白質溶液；同時，使用經(jīng)過滅菌處理的小管來保存蛋白質，防止微生物污染，確保蛋白質處于一個無菌的環(huán)境中。
（三）避免震蕩
震蕩過程中產(chǎn)生的剪切力以及氣泡中的氧氣會對蛋白質造成雙重傷害。剪切力可能破壞蛋白質的分子結構，而氧氣則容易引發(fā)蛋白質的氧化反應，導致蛋白質的活性喪失。因此，在蛋白質的制備、保存和使用過程中，應盡量避免劇烈震蕩，保持操作的平穩(wěn)性。
蛋白質的穩(wěn)定性對于眾多生物學研究和生物工程應用具有舉足輕重的意義。了解影響蛋白質穩(wěn)定性的各種因素，并遵循科學合理的保存原則、策略以及注意事項，能夠幫助我們有效地保持蛋白質的理化性質穩(wěn)定，延長其保存時間，確保蛋白質在研究和應用中發(fā)揮其應有的作用。
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