細胞培養(yǎng)的無菌操作基本技術(shù)

細胞培養(yǎng)是一項需要嚴格無菌操作的實驗技術(shù)，以下是關(guān)于細胞培養(yǎng)的無菌操作基本技術(shù)、實驗用品、培養(yǎng)基、抗生素和血清等方面的總結(jié)。

一、無菌操作基本技術(shù)

1. 實驗前準(zhǔn)備：

   - 無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射 30 - 60 分鐘滅菌，用 70% 乙醇擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn) 10 分鐘后開始實驗操作。

   - 每次操作只處理一株細胞株，不共享培養(yǎng)基，避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，用 70%乙醇擦拭無菌操作臺面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn) 10 分鐘以上，再進行下一個細胞株操作。

2. 操作區(qū)域要求：

   - 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品可暫時放置，其它實驗用品用完即移出，以利于氣流流通。

   - 實驗用品以 70%乙醇擦拭后帶入無菌操作臺，實驗操作應(yīng)在臺面中央無菌區(qū)域，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

3. 取用物品注意事項：

   - 小心取用無菌實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，不在打開的容器正上方操作實驗。

   - 容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員安全：

   - 工作人員應(yīng)穿戴實驗衣及手套后進行實驗。對于來自人類或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壍臒o菌操作臺（至少 Class II）。

   - 操作過程中，避免引起 aerosol 產(chǎn)生，小心毒性藥品如 DMSO 及 TPA 等，避免尖銳針頭傷害。

5. 定期檢測項目：

   - 檢測 CO2 鋼瓶的 CO2 壓力。

   - 檢測 CO2 培養(yǎng)箱的 CO2 濃度、溫度及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。

   - 檢測無菌操作臺內(nèi)的 airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及 HEPA 過濾膜、預(yù)濾網(wǎng)（300 小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時 /HEPA）。

6. 水槽處理：

   - 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

二、實驗用品

1. 種類：

   - 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除玻璃容器與 pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。

   - TC 級培養(yǎng)盤表面有 coating 高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有 Tflask 、plates、dishes、roller bottle 等，依實驗需要使用。

   - 塑料無菌吸管：1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、25 ml。

   - 塑料離心管：15 ml、50 ml，有兩種不同材質(zhì)， polypropylene（PP）為不透明材質(zhì)，polystyrene（ PS ）為透明材質(zhì)，可依實驗需要選擇。

   - glass pastuer pipet：9 inch，用于抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

   - 玻璃血清瓶：100 ml、250 ml、 500 ml、1000 ml。

2. 清洗：

   - 新購玻璃血清瓶先以 0.1 - 0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后使用。

   - 用過的玻璃血清瓶，高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。

3. 滅菌：

   - 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌 121 oC，15 lb ，20 分鐘，置于 oven 中烘干。

   - 實驗用玻璃 pasteur pipet 以干熱滅菌 170 oC ，4 小時。

   - 液體或固體廢棄物可用 10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水）或蒸汽高壓滅菌 121 oC ，15 lb，20 分鐘處理。

三、培養(yǎng)基

1. 貯存與使用：

   - 液體培養(yǎng)基貯存于 4 oC 冰箱，避免光照，實驗進行前放在 37 oC 水槽中溫?zé)帷?/span>

   - 液體培養(yǎng)基（加血清）存放期為六個月，期間 glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可添加適量 glutamine 。

2. 粉末培養(yǎng)基配制：

   - 粉末培養(yǎng)基之配制體積為 900 ml，pH 為 7.2 - 7.4，須添加 10%血清。NaHCO3 為另外添加，應(yīng)分別溶解粉末培養(yǎng)基及 NaHCO3 粉末后再混合，用 CO2 氣體調(diào)整 pH。

   - 材料包括純水、粉末培養(yǎng)基、NaHCO3、電磁攪拌器、無菌血清瓶、無菌過濾膜、pH meter 、真空幫浦、CO2 氣體等。

   - 步驟為溶解粉末培養(yǎng)基、溶解 NaHCO3 粉末并通入 CO2 氣體至飽和、混合兩種溶液、調(diào)整 pH、過濾滅菌、分裝并貯存于 4 oC，同時配制之培養(yǎng)基需作生長試驗與污染測試。

3. 配制培養(yǎng)基之生長測試：

   - 材料有 MDCK cell、6-well TC plate 、methanol、glacial acetic acid、10% Giemsa solution 。

   - 步驟包括培養(yǎng) MDCK cell、觀察細胞群落生長、固定細胞、染色、計數(shù)群落數(shù)并比較，若新配制或新批號培養(yǎng)基對細胞生長不佳則丟棄。

四、抗生素

1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素，培養(yǎng)自 ATCC 引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素；培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作 token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，通過污染測試后大量培養(yǎng)時不加抗生素。

2. 寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個 flask 時，則須添加抗生素（penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml ）。

3. 若要檢測 mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加 gentamicin，因 gentamicin 會抑制 mycoplasma 生長。

4. 去除細菌污染之抗生素混合配方為 penicillin 250 units/ml，streptomycin 250 ug/ml ，neomycin 250 ug/ml，bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。

5. 表中列出了不同抗生素的使用種類、工作濃度、儲存溫度及殺滅細菌類型。

五、血清

1. 貯存要求：

   - 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于 4℃，請勿超過一個月。

   - 可將血清分裝于無菌 50 ml 離心管中，預(yù)留血清結(jié)凍時體積增加約 10% 的空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂。

2. 處理方法：

   - 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3. 解凍步驟：

   - 瓶裝血清采用逐步解凍法，從–20 oC 或–70 oC 至 4 oC 冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻，勿直接由–20 oC 直接至 37 oC 解凍。

4. heat-inactivation：

   - 指 56 oC，30 分鐘加熱已解凍之血清，目的是使血清中之補體成份去活化，除非必須，一般不建議作此熱處理，會造成沉淀物增多且影響血清品質(zhì)。

5. 注意事項：

   - 勿將血清置于 37 oC 太久，否則血清會變得混濁，影響血清品質(zhì)。

6. 血清之沉淀物：

   - 凝絮物：由血清中之脂蛋白變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白造成，可用離心去除，或離心后上清液加入培養(yǎng)基中一起過濾，不建議用過濾步驟去除，以免阻塞過濾膜。

   - 顯微鏡下觀察之“小黑點"：通常經(jīng)過熱處理的血清沉淀物會顯著增多，這些小黑點一般不會影響細胞生長，但若懷疑血清品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號血清。

7. 血清之生長測試：

   - 材料有 MDCK cell、a-MEM、 6-well TC plate、methanol、glacial acetic acid 、 10% Giemsa solution。

   - 步驟包括培養(yǎng) MDCK cell 至 80% confluency 、處理細胞制成懸浮液并測濃度、接種細胞入 6-well plate 并加入不同濃度血清的 a-MEM、培養(yǎng)、固定、染色、計數(shù)群落數(shù)、計算 SPE 和 RPE，比較各濃度血清培養(yǎng)基之 RPE，可知待測血清對細胞生長的影響。同時，可訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于– 70 oC 保存。

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