聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，在生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。深入了解 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，對(duì)于準(zhǔn)確、高效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 非常重要。
一、標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 反應(yīng)體系
標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 反應(yīng)體系包含多個(gè)關(guān)鍵成分。主要有：
10×擴(kuò)增緩沖液，它為反應(yīng)提供穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境。4 種 dNTP 混合物，即脫氧核糖核苷三磷酸（包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各以 200umol/L 的濃度存在于體系中，為 DNA 合成提供原料。引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，各 10～100pmol 的引物決定了擴(kuò)增的起始位置和方向。模板 DNA 的量通常在 0.1～2ug 之間，它是待擴(kuò)增的目標(biāo) DNA 片段。Taq DNA 聚合酶以 2.5u 的量參與反應(yīng)，催化 DNA 合成。Mg2+濃度為 1.5mmol/L，它對(duì) PCR 反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量有顯著影響。最后，通過(guò)加入雙或三蒸水將反應(yīng)體系調(diào)整至 100ul。
二、PCR 反應(yīng)五要素
PCR 反應(yīng)主要由五種物質(zhì)組成，即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。
引物是決定 PCR 特異性的關(guān)鍵因素。其長(zhǎng)度通常在 15 - 30bp 之間，20bp 左右較為常用。合適的引物長(zhǎng)度有助于確保特異性結(jié)合和高效擴(kuò)增。引物擴(kuò)增跨度以 200 - 500bp 為宜，這樣可以在保證特異性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段的有效擴(kuò)增。引物堿基中 G + C 含量以 40 - 60%為宜，ATGC 最好隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)連續(xù)的 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列，以減少非特異性結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，要避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及兩條引物間互補(bǔ)，防止形成引物二聚體。引物 3`端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，否則可能導(dǎo)致 PCR 失敗。
此外，引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，對(duì)于后續(xù)的酶切分析或分子克隆非常有好處。并且引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性，以確保特異性。引物濃度也需謹(jǐn)慎控制，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，還會(huì)增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
酶在 PCR 反應(yīng)中起著核心作用。目前主要有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為 100ul 時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。
dNTP 即脫氧核糖核苷三磷酸，在 PCR 反應(yīng)中為 DNA 合成提供原料。dNTP 粉呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。應(yīng)配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris.HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。在 PCR 反應(yīng)中，dNTP 應(yīng)為 50～200umol/L，并且 4 種 dNTP 的濃度要相等，任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低會(huì)降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量，而濃度過(guò)高又會(huì)與 Mg2+結(jié)合使游離的 Mg2+濃度降低。
模板 DNA 是 PCR 反應(yīng)的目標(biāo)。傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來(lái)消化處理標(biāo)本，提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。對(duì)于一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于 PCR 擴(kuò)增。RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，同時(shí)要特別注意防止 RNase 降解 RNA。
Mg2+對(duì) PCR 擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有較大影響。在一般的 PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時(shí)，Mg2+濃度為 1.5～2.0mmol/L 為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
三、PCR 反應(yīng)條件設(shè)置
PCR 反應(yīng)基于原理三步驟而設(shè)置變性 - 退火 - 延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。對(duì)于較短靶基因可采用二溫度點(diǎn)法。
變性是 PCR 反應(yīng)的一步驟，其目的是使雙鏈 DNA 解鏈為單鏈。變性溫度一般為 93℃～94℃，時(shí)間為 1min。變性溫度低，解鏈不全是導(dǎo)致 PCR 失敗的最主要原因。但溫度也不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。
退火是第2步，在這一步引物與模板發(fā)生結(jié)合。退火溫度取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于 20 個(gè)核苷酸，G+C 含量約 50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。退火溫度可通過(guò)公式 Tm 值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，復(fù)性溫度=Tm 值-(5～10℃)來(lái)幫助選擇合適的溫度。在 Tm 值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR 反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為 30～60sec，足以使引物與模板之間相結(jié)合。
接下來(lái)是延伸，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。延伸溫度一般選擇在 70～75℃之間，常用溫度為 72℃。過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸時(shí)間可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般 1Kb 以?xún)?nèi)的 DNA 片段，延伸時(shí)間 1min 是足夠的。3～4kb 的靶序列需 3～4min；擴(kuò)增 10Kb 需延伸至 15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。
總之，準(zhǔn)確理解和掌握 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，對(duì)于成功進(jìn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。只有在合適的反應(yīng)體系和條件下，才能實(shí)現(xiàn)高效、特異性的 DNA 擴(kuò)增，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供可靠的基礎(chǔ)。
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