實時熒光定量 PCR（RT-QPCR）技術(shù)是一種高靈敏度的分子生物學檢測方法，廣泛應(yīng)用于生命科學研究的多個領(lǐng)域。本文將詳細介紹使用 Q2000B 熒光定量 PCR 儀進行 RT-QPCR 實驗的操作流程，幫助讀者更好地理解和應(yīng)用這一技術(shù)。
一、實驗前準備
在進行實時熒光定量 PCR 實驗前，需要準備好實驗所需的各種試劑和耗材。試劑包括特異性 PCR 引物、新鮮提取的總 RNA 以及相關(guān)的試劑盒。此外，還需要確認所需的儀器和耗材，如實時定量 PCR 儀、多孔板等。
二、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：包括模板、引物、dNTP 混合物等。
2. 進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用總 RNA 合成 cDNA 第一鏈。
三、Q-PCR 擴增
1. 配置 PCR 反應(yīng)體系：包括 cDNA 產(chǎn)物、Master Mix、引物等。
2. 設(shè)置 PCR 程序，包括預(yù)變性、擴增循環(huán)、延伸等步驟。
3. 運行 PCR 實驗，實時監(jiān)測樣品擴增情況。
四、數(shù)據(jù)分析
1. 樣品編輯：設(shè)置陰性對照、空白對照、標準品和未知樣品等。
2. 結(jié)果分析：查看擴增曲線、標準曲線、Cp 值等數(shù)據(jù)。
五、Q2000B 熒光定量 PCR 儀的特點
1.角度調(diào)節(jié)屏幕：儀器屏幕角度可 90° 調(diào)節(jié)，適合不同視角使用。
2. 同步熒光檢測：相同通道的熒光檢測同步，延時誤差減少。
3. 全真彩觸控屏：自帶 10 英寸全真彩觸控屏，可以在屏幕上編輯、查看、運行的定量 PCR 和普通 PCR 程序，無需連接電腦。
4. 新一代半導(dǎo)體升降溫技術(shù)：采用進口半導(dǎo)體芯片，變溫速率可達 6 °C/SEC，使用壽命達 100 萬次循環(huán)。
5. 頂部檢測技術(shù)：采用頂部檢測技術(shù)，屏蔽背景干擾，提高熒光信號靈敏度和信噪比，可使用白管和透明管，獲得準確結(jié)果。
6. 溫度梯度功能：具有溫度梯度功能，優(yōu)化反應(yīng)條件，并配有遠程操控，實時查看實驗數(shù)據(jù)及分析結(jié)果。
7. SSLPTM 短光程靜態(tài)熒光 CCD 成像技術(shù)：采用 SSLPTM 短光程靜態(tài)熒光 CCD 成像技術(shù)，熒光信號穩(wěn)定、靈敏。
六、熒光定量 PCR 實驗操作流程
1. 打開 Q2000B 熒光定量 PCR 儀，確認儀器設(shè)置正確。
2. 在全真彩觸控屏上編輯 RT-QPCR 實驗程序，包括預(yù)變性、擴增循環(huán)、延伸等步驟。
3. 配置 PCR 反應(yīng)體系，加入 cDNA 產(chǎn)物、Master Mix、引物等。
4. 將反應(yīng)體系分裝至多孔板中，設(shè)置陰性對照、空白對照、標準品和未知樣品等。
5. 將多孔板放入 Q2000B 熒光定量 PCR 儀中，啟動實驗程序。
6. 實時監(jiān)測樣品擴增情況，觀察擴增曲線、標準曲線、Cp 值等數(shù)據(jù)。
7. 實驗結(jié)束后，對數(shù)據(jù)進行分析，計算樣品中目的基因的濃度。
七、注意事項
1. 確保所有 RNA 相關(guān)的操作均佩戴手套，防止 RNase 污染。
2. 嚴格按照試劑盒說明進行操作，避免使用渦旋振蕩。
3. 確保 PCR 儀器的正確設(shè)置，以獲得準確的擴增結(jié)果。
4. 試劑需在規(guī)定條件下儲存和使用，如 SYBR Green I Master 需避光放置。
5. 注意數(shù)據(jù)分析方法的選擇，如標準曲線法、絕對定量法等。
Q2000B 熒光定量 PCR 儀 能夠提供高靈敏度和高準確度的 RT-QPCR 實驗結(jié)果。通過合理選擇實驗方法、嚴謹操作和準確分析，可以確保實驗結(jié)果的可靠性和準確性。掌握該技術(shù)的基本原理和操作要點，對于提高科研水平和醫(yī)學研究能力具有重要意義。更多實驗室儀器設(shè)備請進入蘇州阿爾法生物網(wǎng)站進行了解。
