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PCR標準操作流程詳解

 更新時間:2024-08-09 點擊量:178

PCR標準操作流程詳解
一、概述
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)是一種在體外合成雙鏈DNA的技術(shù)。其原理模仿了天然DNA的復制過程,通過特異引物和高特異性酶,確保反應的特異性。典型的PCR反應包括三個步驟:變性、退火和延伸,通過多次循環(huán),最終獲得目標DNA片段。

朗基無墻壁獎.jpg


二、試劑準備
以下為進行PCR反應所需的試劑及其終濃度:

試劑 終濃度

PCR buffer 1x

dNTPs <0.4mM

Forward primer <0.4uM

Reverse primer <0.4uM

Template DNA <100ng

熱啟動酶 5U

ddH2O Up to 50 ul

三、操作步驟
1. 配置反應體系
將以下成分按順序加入0.5ml的離心管中:
l 加入PCR buffer。
l 加入dNTPs。
l 加入Forward primer。
l 加入Reverse primer。
l 加入Template DNA。
l 加入熱啟動酶。
l 用ddH2O補至總體積50 ul。
注意:使用熱啟動酶時,可在常溫下操作;非熱啟動型酶需在低溫下配置反應體系。 
2. 設置反應條件
根據(jù)試劑盒說明書設置反應時間和溫度,完成擴增后進行電泳鑒定。

天能水平電泳槽.jpg

3. 瓊脂糖核酸電泳
① 準備電泳器具,用蒸餾水洗凈并架好梳子。
② 根據(jù)所需分離的DNA片段大小,制備適當濃度的瓊脂糖凝膠。
③ 將瓊脂糖和電泳緩沖液(TAE或TBE)加入錐形瓶中,加熱融化后冷卻至40℃左右,混勻并倒入電泳槽。
④ 室溫下凝固凝膠,拔出梳子,準備點樣。
⑤ 在電泳槽中加入電泳緩沖液,確保覆蓋凝膠表面。
⑥ 混合5ul樣品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料,緩緩注入點樣孔,避免串孔。
⑦ 接通電源(紅正黑負),設置電壓40-60V,電泳時間30-40min,根據(jù)溴酚藍的位置判斷是否終止電泳。
⑧ 電泳結(jié)束后,關(guān)閉電源,進行凝膠成像觀察,并對比marker確定片段大小。
不同瓊脂糖濃度對應的DNA片段大小如下表:

瓊脂糖濃度/% DNA 大小 /kb

0.3 5-60

0.5 1-30

0.7 0.8-12

1.0 0.5-10

1.2 0.4-7

1.5 0.2-3

2.0 0.05-2

四、注意事項
引物設計
? 引物應設計在cDNA的保守區(qū)域。
? 引物長度應在15-28bp之間。
? GC含量應在40%-60%之間。
? 避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),完成后進行BLAST驗證。

朗基PCR.jpg


模板DNA
? 模板可以是單鏈或雙鏈DNA。
? 不同來源的模板起始濃度有一定要求。
? 模板提取后應注意保存,避免降解。
其他
? 選擇合適的Taq DNA聚合酶。
? 確保四種dNTP濃度相同。
? 操作過程中戴手套,保持環(huán)境干凈,防止污染。
? PCR用水需經(jīng)過高壓滅菌或0.2um濾膜過濾。
五、常用試劑配方
電泳緩沖液
50xTAE(pH8.5)
Tris 242g
EDTA(Na)37.2g
? 加入800ml去離子水,攪拌溶解
? 加入57.1ml乙酸,調(diào)pH至8.5后定容至1L
10xTBE(pH8.3)
Tris 108g
EDTA 7.44g
硼酸55g
? 加入800ml去離子水,攪拌溶解,調(diào)pH至8.3后定容至1L
上樣緩沖液(6xLoding buffer)
0.25%二甲苯青
0.25%溴酚藍

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