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大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 的提?。▔A裂解法)

 更新時間:2023-09-14 點擊量:784


 

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA 的提取提取的質(zhì)粒 DNA 可直接用于酶切PCR 擴增。

1.   1.5ml 細菌培養(yǎng)物于 EP 管中, 4000rpm  離心 1 分鐘, 棄上清液, 使細菌沉 淀盡量干燥;

2.   將細菌沉淀重懸于用冰預冷的 100 μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖, 10 mmol/L EDTA pH 8.0 25 mmol/LTris-HCl pH 8.0)  中,劇烈振蕩;

3.   加入 200 μl 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH ,1SDSm/v),蓋緊 EP 管 口,快速顛倒離心管 5 次,以混合混合物,確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液 II 接觸,不要渦旋,置于冰浴中;

4.   加入 150 μl 預冷溶液 III(100 ml  的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L   乙酸鉀,11.5 ml 冰乙酸, 28.5 ml H2O),蓋緊 EP 管口,反復顛倒數(shù)次,使溶液 III 在粘稠 的細菌裂解物中分散均勻,之后將管置于冰上 3~5 分鐘;

5.   在最大轉(zhuǎn)速下離心 5min,取上清液于另一新 EP 管;

6.   用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈 DNA,振蕩混合于室溫放置 2 分鐘, 最大轉(zhuǎn) 速離心 5 分鐘;

7.   小心吸去上清液,將離心管倒置于濾紙上,以使所有液體都流出,在將附于管壁的液滴除盡;

8.   1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用 12,000g 離心 2 分鐘,棄上清,將 開口的 EP 管置于室溫使乙醇揮發(fā), 直至 EP 管中內(nèi)沒有可見的液體存在(5 ~ 10 分鐘),用適量的 ddH2O 溶解;

9.   0.5μl RNase 37℃溫育 5~10 分鐘;

10. 電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA

1.    加入 1/10 體積的乙酸鈉(3mol?L,PH=5.2)于 DNA 溶液中充分混勻, 使其 最終濃度為 0.3 mol?L;

2.    加入 2 倍體積用冰預冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中 15~30 分鐘;

3.    12,000 g 離心 10 分鐘,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴;

4.    加入 1/2  離心管容量的 70%乙醇, 12000g  離心 2 分鐘, 小心移出上清液, 吸 去管壁上所有的液滴;

5.    于室溫下將開蓋的 EP 管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干;

6.    加適量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。

 

1.   酶切前確定待切樣品的濃度,  并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套 Buffer。 2.   在離心管中加入如下成分:

10 ×Buffer     1μl

待切樣品  xμl

       0.5-1μl

加水補足 10μl

3.   混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.   將離心管置于 37℃中溫育 1-3hr,若待切樣品為 PCR 產(chǎn)物, 則可將反應時間 適當延長。

5.   用未酶切的質(zhì)粒作為對照,瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

注:當酶切樣品用于回收而不是鑒定時,可按比例適當加大反應體積。雙酶 切可選用二者活性都較高的 Buffer 或者通用 Buffer,但要注意不能有星反應。)

1.   連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。

2.   在離心管中加入如下成分:

10 ×連接 Buffer 1μl

待連接的樣品(膠回收產(chǎn)物或 PCR 產(chǎn)物,載體與片段的 mol 比為 13-5

連接酶 0.5-1μl                                                                            

加水補足 10μl

3.   混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4.   將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當?shù)臅r間(根據(jù)不同公司的酶的要求

而定, 一般為 221-3hr 16℃連接過夜)。

連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化,也可放 4℃冰箱短期保存。