重組克隆的篩選與鑒定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
通過(guò)篩選，獲得含目的片段的重組克隆。掌握利用酶切或PCR方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定步驟。
二、實(shí)驗(yàn)原理
藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。
由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pUC。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行酶切或PCR等進(jìn)一步鑒定。
三、主要試劑
胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂、Amp、IPTG、X-Gal
四、儀器耗材
超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、平皿、移液器、tip。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 記錄樣品的轉(zhuǎn)化子總數(shù)，白色和藍(lán)色菌落各有多少。
2. 記錄對(duì)照2的菌落數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)化頻率。
3. 挑取一個(gè)白色菌落，接于2mL的LB中
4. 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
5. 快速堿裂解法抽提質(zhì)粒，具體方法參見(jiàn)同實(shí)驗(yàn)二。
6. 酶切，同時(shí)以提取的質(zhì)粒作對(duì)照，具體方法參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)三。
取2μL質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：10×bf 2μL，限制酶各0.5μL，H2O 15μL。37度，2-4hr。0.8-1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
7. 或者使用PCR鑒定陽(yáng)性克隆，具體方法參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)一。
六、注意事項(xiàng)
1. IPTG和X-Gal在培養(yǎng)基上一定要涂勻。
2. 平板如在培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。
思考題：
1. 如果一個(gè)DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA 未被切動(dòng)，你認(rèn)為可能是什么原因？
2. 請(qǐng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的具體原因。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：如果電泳后（1）只有載體條帶，看不到插入片段的條帶？（2）出現(xiàn)2條以上的條帶？如何解釋。
4. 本實(shí)驗(yàn)的目的是克隆基因Xbc，為基因表達(dá)做準(zhǔn)備。你認(rèn)為經(jīng)過(guò)酶切鑒定是否獲得了Xbc的陽(yáng)性克?。繛槭裁?？并寫(xiě)出后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟或計(jì)劃。
蘇州阿爾法生物是一家集生命科學(xué)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)耗材和實(shí)驗(yàn)試劑供應(yīng)于一身的專業(yè)公司。阿爾法生物產(chǎn)品覆蓋生命科學(xué)研究、生物制藥、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng)域，包括的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有生物顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、蛋白電泳系統(tǒng)、數(shù)字PCR儀、高通量分析儀、高速冷凍離心機(jī)、超速離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)、低速離心機(jī)、落地式離心機(jī)、迷你離心機(jī)、真空濃縮儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、生物反應(yīng)器、細(xì)菌培養(yǎng)箱研磨儀等，實(shí)驗(yàn)耗材常用的nest培養(yǎng)瓶、rainin移液槍tip頭、離心管、PCR管、8聯(lián)排管、三角搖瓶、培養(yǎng)皿等，實(shí)驗(yàn)試劑包括天根試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、蛋白抗體、碧云天試劑、阿拉丁試劑、腫瘤細(xì)胞株、基因編輯細(xì)胞、支原體清除試劑盒等。阿爾法生物一直與國(guó)際生命科學(xué)儀器廠商以及一些新興科技公司保持著深度的合作關(guān)系，這也為產(chǎn)品供應(yīng)和技術(shù)支持提供了有力保障。 作為十四年年專注于實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)耗材和實(shí)驗(yàn)試劑供應(yīng)商，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)使用，還是科研人員的前沿探索，阿爾法生物都能夠為您提供良好的軟硬件支持和快捷、周到的服務(wù)。更多實(shí)驗(yàn)室儀器、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材采購(gòu)相關(guān)問(wèn)題可以進(jìn)入蘇州阿爾法生物進(jìn)行了解。
