CCK-8細胞活性檢測實驗步驟

  CCK-8實驗可用于細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，可間接性反應(yīng)活細胞的數(shù)量。使用CCK-8試劑盒進行細胞活性檢測是一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。
CCK-8細胞活性檢測實驗步驟：
一、實驗前準(zhǔn)備：
酒精燈、移液槍、酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）、96孔培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、CCK-8、細胞計數(shù)板、PBS等。
二、繪制曲線
1.制備細胞懸液：選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞制作細胞懸液，并計數(shù)。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ：按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做5-7個細胞濃度梯度（比如，稀釋10倍，100倍......），每組4-6個復(fù)孔。
3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：接種后培養(yǎng)一定時間待細胞貼壁后，然后每100μL培養(yǎng)基加10μL（10%）CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可測定出未知樣品在條件一致的前提下的細胞數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線還有助于確定細胞接種的合適數(shù)量以及摸索CCK-8后所需孵育時間。
三、細胞增殖檢測

1.制備細胞懸液：選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞制作細胞懸液，并計數(shù)。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)（根據(jù)自身的細胞類型而定，以一周能鋪滿為宜，若為血液細胞密度可適當(dāng)增大），每孔接種約100ul細胞懸液，每組設(shè)置4-6個復(fù)孔。
①當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。懸浮細胞由于染色比較困難一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。
②當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。為減少誤差，最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培養(yǎng)液，不作為測定孔用。
③接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不一致。3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）12-24小時，使細胞達到指數(shù)期（培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內(nèi)細胞數(shù)量的多少而異）。
4.每孔加入10ul CCK-8試劑
①由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議直接配置含10% CCK-8培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配）以換液的形式加入。注意加CCK-8試劑時不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)。加CCK-8試劑時速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入CCK-8試劑后輕輕震培養(yǎng)板。
②加CCK-8試劑時間可分別在22h、46h、70h、94h時加入，也可以在24h、48h、72h、96h時再加入。重要的是需保證實驗組和對照組在同一時間點進行實驗。
③若細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8。5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4小時①培養(yǎng)時間因孔中細胞的類型和數(shù)量而異，需要自己摸索，因為細胞種類不同，形成Formazan的量也不一樣。
②如果顯色太淺的話，可以將96孔板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，可參考標(biāo)準(zhǔn)曲線確定培養(yǎng)時間。
③一般情況下，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（最多 4 h）或增加細胞數(shù)量。
④CCK-8 的反應(yīng)時間以具體顯色的適宜時間為準(zhǔn)?？稍?.5h、1.0h、2.0h分別觀察培養(yǎng)基的顏色。最佳OD 值控制在1.0左右較合適。6.使用酶標(biāo)儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）。實驗重復(fù)3次，取實驗結(jié)果的平均值作為最終實驗結(jié)果。

空白對照的設(shè)定：在同體積的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)同樣的時間，和實驗組一起測定450nm的吸光度。
①使用酶標(biāo)儀檢測時記得打開96孔板蓋子，需保證酶標(biāo)板的表面以及板底是干凈的，且每個待測孔內(nèi)沒有氣泡，以免干擾實驗結(jié)果。
②如果結(jié)果出現(xiàn)“overflw"則需降低細胞接種密度，如果因?qū)嶒炐枰荒軠p少細胞數(shù)時可縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。
③如果樣品為高渾濁的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。（CCK-8 在參比波長處沒有吸光值，設(shè)定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。）
④若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
     蘇州阿爾法生物提供的酶標(biāo)儀、移液槍、Co2培養(yǎng)箱、顯微鏡、細胞計數(shù)儀等實驗室設(shè)備和酶標(biāo)板、96孔板、離心管、PCR八聯(lián)排管、移液槍吸頭等實驗耗材以及CCK-8試劑盒、PBS緩沖液、培養(yǎng)基等生物試劑用于CCK-8細胞增殖檢測。