實時定量PCR技術(shù)中常見問題匯總
實時定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術(shù)，目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域，qPCR核酸定量的主要方法。目前仍在全球肆虐的病毒鑒定的“金標準"——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的。
那么拿到一個樣本，需要經(jīng)過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導(dǎo)致它的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常！
1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
e) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。
2、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設(shè)計引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復(fù)實驗。
c) 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實驗。
d) PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時帶入，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗。
3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實驗過程中，更換新的Mix或者水重復(fù)實驗。
b) 標本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，對實驗室進行嚴格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。
4、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴增。
b) 引物設(shè)計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當調(diào)整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設(shè)計引物避免非特異性擴增。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴增效率低
a) 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應(yīng)條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
7、實驗重復(fù)性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。
蘇州阿爾法生物提供的PCR儀系列主要有A100基因擴增儀、A200PCR儀、A300快速PCR儀、A600梯度PCR儀、T20PCR儀、Q2000B高通量熒光定量PCR儀、便攜式PCR儀等。
