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SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA簡(jiǎn)介

 更新時(shí)間:2022-12-01 點(diǎn)擊量:945

   近些年來,隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn),以及DNA克隆和測(cè)序方法的發(fā)展,對(duì)大量質(zhì)粒載 體和重組子的需求也大大減少。
  在本方案中,通過 堿裂解法的放大(Birnboim and Doly 1979),質(zhì)粒DNA可從清亮的細(xì)菌裂解物中通過含有 漠化乙錠的CsCl梯度離心來進(jìn)行純化。
  無論是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒還是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒,通過這種方法可以得到每毫升3?5^g 的DNA。重組子的質(zhì)粒一般產(chǎn)量較少,這取決于克隆的DNA片段的大小和特點(diǎn)。
材料
為正確使用本方案中的器材和危險(xiǎn)試劑,必須查閱相應(yīng)的材料安全數(shù)據(jù)表并咨詢所在機(jī)構(gòu)的環(huán)境衛(wèi)生和安全辦公室。
儲(chǔ)備溶液應(yīng)稀釋至適用濃度后使用。
試劑
瓊脂糖凝膠(見步驟8和19)
堿裂解液I<A>
若用柱層析進(jìn)一步純化所制備的質(zhì)粒DNA (見本章導(dǎo)言中"純化DNA的商業(yè)試劑盒”部分),無菌的堿裂解 液I在使用前可補(bǔ)充適當(dāng)體積的無DNA酶的RNA20mg/mL,RNA酶),使終濃度為lOOpg/mL,若用其他 方法純化DNA,不推薦在此步驟中加RNA酶。
堿裂解液II<A>
現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫使用。
堿裂解液III<A>
用于篩選質(zhì)粒的抗生素
轉(zhuǎn)化了目的質(zhì)粒的細(xì)菌克隆
氯霉素(34mg/mL)(可選;見步驟4)
乙醇
異丙醇
溶菌酶(10mg/mL)
限制性內(nèi)切核酸酶
培養(yǎng)基(LB、YT 或者 Terrific Broth) <A>,預(yù)熱到 37°C
STE<A>,冰浴
TE (pH8.0) <A>
附加試劑
步驟8和步驟19需要第2章方案1中列出的試劑。步驟18需要柱層析所用材料(見 本章導(dǎo)言)。
設(shè)備
有蓋的培養(yǎng)瓶(125mL, 2L)
知楚搖床,預(yù)設(shè)到37°C
RC6 Plus離心機(jī)帶轉(zhuǎn)頭,合適容量(Thermo Scientific)
分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞制備

  • 挑取轉(zhuǎn)化的細(xì)菌單菌落或用0.1?l.OmL單菌落的培養(yǎng)物,接種到30mL含有適當(dāng) 抗生素的培養(yǎng)基中(LB、YT或者Terrific Broth)o

為確保培養(yǎng)物通氣良好:
?試管的體積應(yīng)該至少比細(xì)菌培養(yǎng)物的體積大4倍。試管蓋要蓋得松些。
•培養(yǎng)物要在劇烈振蕩下培養(yǎng)。

  • 在適當(dāng)?shù)臏囟群蛽u速下培養(yǎng)菌液直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期(OD6oo約為0.6)。

  • 在含有500mL的LB、YT或者Terrific Broth培養(yǎng)液(預(yù)熱到37°C )及適當(dāng)抗生素 的燒瓶(2L)中接種25mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期的菌液。將此培養(yǎng)液在37°C劇烈振蕩(300cycles/ min),培養(yǎng) 2.5h»

最后菌液的ODao應(yīng)為0.4。由于不同菌株的生長(zhǎng)速度不同,可稍微延長(zhǎng)或縮短培養(yǎng)時(shí)間,使最終的OD值為0.4。

  • 若質(zhì)粒為低或中拷貝數(shù)的質(zhì)粒,在培養(yǎng)液中加2.5mL濃度為34mg/mL的氯霉素, 使其終濃度為170ng/mLo

A對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒,不必添加氯霉素。

  • 在 37°C 以 300cycles/min 振蕩 12~16h。

  • 取部分菌液(1?2mL)到離心管中,4°C儲(chǔ)存。2700g離心15min以收集余下的近 500mL培養(yǎng)物。棄上清,倒置離心管使殘余上清流出。

  • 用200mL冰預(yù)冷的STE重懸細(xì)菌沉淀,按步驟6所述重新收集細(xì)菌并儲(chǔ)存在-20°C。

  • 采用方案1中的方法或使用商品化試劑盒,從步驟6中取出的1?2mL菌液中提取 質(zhì)粒,并釆用酶切和瓊脂糖電泳分析此少量制備的質(zhì)粒DNA,以確定大量培養(yǎng)菌液中獲得 的質(zhì)粒正確。

設(shè)置這種對(duì)照可能看上去有點(diǎn)過于謹(jǐn)慎,然而它可以避免發(fā)生某些難以挽回的、浪費(fèi)大量時(shí)間的錯(cuò)誤。
細(xì)胞裂解

  • 將步驟7中凍存的細(xì)菌在室溫下放置5?lOmin使其解凍,用18mL (10mL)堿裂 解液I重懸。

如果步驟4中使用了氯霉素的菌液,則使用括號(hào)中的體積數(shù)。
10. 加2mL (ImL)新配制的10mg/mL溶菌酶。

  • 加40mL (20mL)新配制的堿裂解液II。蓋上離心管蓋,輕輕顛倒數(shù)次,混 勻,室溫放置5~10min。

延長(zhǎng)超螺旋DNA暴露于堿的時(shí)間會(huì)使其不可逆變性,所產(chǎn)生的環(huán)狀卷曲DNA不能被限制酶切割,而且它在 瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋DNA2倍,難以被漠化乙錠染色。從細(xì)菌中用堿裂解法提質(zhì)粒時(shí)可能會(huì)看 到微量的這種DNA.

  • 加20mL (15mL)冰浴冷的堿裂解液III。蓋上離心管蓋,輕輕地但振蕩混勻 (此時(shí)不應(yīng)再有兩個(gè)液相)。將離心管在冰上放置lOmino

在放置過程中會(huì)出現(xiàn)由染色體DNA、高分子質(zhì)量RNA,鉀離子、SDS、蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁復(fù)合物一起形成的乳 白色沉淀。
在堿裂解液HI中最好使用乙酸鉀而非乙酸鈉,因?yàn)槭榛宜徕淃}比鈉鹽難溶•
13. 4°C用>20 000g離心30min,讓轉(zhuǎn)子自動(dòng)停止,無須制動(dòng)。將上清輕輕移入量筒中, 棄去沉淀。
不能形成緊密沉淀的原因一般是加入堿裂解液II時(shí)沒有充分混勻(步驟ID.如果細(xì)菌碎片不能形成緊密的 沉淀,以20 OOOg再次離心15min,將上清移入干凈的離心管。轉(zhuǎn)移時(shí)可用4層紗布過濾上清,可以除去黏稠的基 因組DNA和蛋白質(zhì)沉淀。
質(zhì)粒DNA回收

  • 量取上清體積,將其連同0.6倍體積的異丙醇一起移入一支干凈離心管中并將其 充分混勻,室溫下放置lOmin。

15. 在室溫下以12 OOOg離心15min回收核酸沉淀。
若在4莒離心會(huì)使鹽沉淀下來。

  • 小心棄去上清,將離心管敞開蓋,倒置于紙巾除去殘余上清。在室溫下用70%乙 醇涮洗管壁,倒掉乙醇,并除去管壁的液滴。將離心管開口倒置于紙巾上使剩余乙醇揮發(fā)掉。

如果用干燥器或者真空干燥的方法干燥DNA沉淀,在某些情況下會(huì)使其難以溶解并可能變性(Svaren et al. 1987).將沉淀在室溫下干燥10~15min使乙醇揮發(fā)就足夠,不會(huì)引起DNA脫水。

  • 用3mL含有2.0卩g/mL無DNA酶的RNase A的TE (pH 8.0)溶解DNA沉淀。輕 柔振蕩溶液。將DNA保存于-20°C O

18. 質(zhì)粒DNA的純化可用商業(yè)樹脂進(jìn)行柱層析(如QIAGEN公司的QIA-prep)。
19. 用DNA測(cè)序及限制性酶切結(jié)合凝膠電泳分析確證質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。

疑難解答
問題(步驟19):由于質(zhì)粒毒性使質(zhì)粒DNA得率低(W1.0卩g/mL)。

解決方案:換成低拷貝數(shù)的質(zhì)?;驍y帶原核生物轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的載體。

問題(步驟19):在酶切前、后經(jīng)電泳只見很少或無DNA。
解決方案:在乙醇沉淀后,在步驟16中可能將核酸丟失。離心后馬上小心地去除乙醇, 如果離心管放置的時(shí)間太長(zhǎng),DNA沉淀會(huì)與管壁分離。

問題(步驟19): DNA不能被限制酶切割。
解決方案:DNA不能切割,可能是沒有移去所有液體,在純化質(zhì)粒DNA的過程中, 有些成分阻礙限制酶的功能??梢試L試以下建議:

  • 在步驟6中移去所有液體。

  • 在步驟7中移去所有STEo

  • 在步驟16中移去所有液體。

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