在設(shè)計用于活細胞成像研究的光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)時，主要考慮因素是檢測器靈敏度（信噪比）、所需的圖像采集速度和樣本活力。在使用活細胞時，必須嚴格避免在記錄固定細胞和組織的圖像時通常使用的相對較高的光強度和較長的曝光時間（其中光漂白是主要考慮因素）。幾乎在所有情況下，活細胞顯微鏡都代表了實現(xiàn)較佳圖像質(zhì)量和保持細胞健康之間的折衷。
原則上，理想的活細胞圖像采集系統(tǒng)應(yīng)該足夠靈敏，可以從弱熒光標(biāo)本中采集優(yōu)質(zhì)圖像，同時足夠快以記錄所有動態(tài)過程。此外，該系統(tǒng)將具有足夠的分辨率來捕捉精細的樣本細節(jié)和能夠準確測量微小的強度差異的寬動態(tài)范圍。但是，如果優(yōu)化這些標(biāo)準中的任何一個都是以犧牲其他標(biāo)準為代價的。因此，目前不可能設(shè)計出適合所有可能研究范圍的通用活細胞成像系統(tǒng)。反而，研究人員必須通過確定較重要的優(yōu)化參數(shù)來做出妥協(xié)，同時仍然試圖限制那些被認為不太感興趣的變量所做出的犧牲。較后，顯微鏡配置較終取決于成像模式的要求、在實驗過程中保持標(biāo)本活力的必要性、標(biāo)記協(xié)議的難度級別以及設(shè)備的可用性。
活細胞成像技術(shù)
活細胞成像是在光學(xué)顯微鏡中使用廣泛的對比度增強成像模式進行的。大多數(shù)研究涉及某種形式的熒光顯微鏡，通常與一種或多種透射光技術(shù)相結(jié)合。比如：熒光技術(shù)包括傳統(tǒng)的寬場落射熒光、激光掃描共聚焦、旋轉(zhuǎn)盤和掃場共聚焦、多光子、全內(nèi)反射 ( TIRF )、熒光相關(guān)光譜、壽命成像 ( FLIM )、光活化和激光捕獲。作為一個子集，它包含：光譜成像、多色成像、共定位、延時序列、光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量轉(zhuǎn)移 ( FRET )、散斑顯微鏡 ( FSM ) 和膜片鉗通常與一種或多種主要成像模式耦合。熒光技術(shù)可以輔以傳統(tǒng)的明場模式，包括微分干涉對比 ( DIC )、霍夫曼調(diào)制對比 ( HMC)) 和相位對比，作為熒光探針定位的確認。在幾乎所有情況下，每種顯微鏡配置都需要一些*的考慮因素，這些因素必須實施才能成功進行活細胞成像。無論采用何種顯微鏡和數(shù)碼相機系統(tǒng)對活細胞和組織進行成像，兩個較重要和限制因素是維持細胞活力和實現(xiàn)高于背景噪聲和自發(fā)熒光的可能信號水平。
活細胞成像中的信噪比
固定細胞成像和活細胞成像之間的根本區(qū)是：固定細胞成像為研究人員提供了足夠的空間來定義圖像采集參數(shù)，例如定位合適的視場和確定曝光時間，以及調(diào)整電子增益設(shè)置、讀出率和偏移值。因此，在大多數(shù)情況下（使用充分染色的固定標(biāo)本）可以獲得利用相機系統(tǒng)的全動態(tài)范圍的圖像，從而產(chǎn)生較佳的信噪比。由于維持細胞活力的嚴格要求對成像參數(shù)的限制，活細胞的情況會有所不同。對于獲得的活細胞圖像，樣本的強度通常只比背景的強度高幾個灰度級。在這種情況下，探測器系統(tǒng)的暗電流和讀取噪聲水平成為細胞成像所必要考慮的條件。 經(jīng)濟型相機通常具有較高的噪聲水平，這樣會導(dǎo)致背景圖像不太均勻，通常會掩蓋來自樣本的信號，隨著讀出速度的提高，這種影響會變得更加嚴重。所以在幾乎所有活細胞成像應(yīng)用中，檢測器的選擇對于決定實驗的成敗至關(guān)重要。
其實，數(shù)字成像中的四個主要噪聲源來自探測器、照明系統(tǒng)、泊松噪聲或散粒噪聲（由于光子通量的隨機性）和雜散光。在大多數(shù)情況下，可以通過仔細選擇檢測器和優(yōu)化照明條件來系統(tǒng)地降低噪聲。幾乎每種類型的光子探測器都會在設(shè)備記錄的每次測量中引入某種形式的噪聲。激光掃描和多光子顯微鏡中使用的光電倍增管可以在信號放大系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生雜散電子。
為了克服傳統(tǒng)高性能 CCD 相機在需要在極低光照水平下快速捕捉幀速率的應(yīng)用的缺點，制造商推出了一種創(chuàng)新方法，用于放大 CCD 讀取本底噪聲以上的微弱信號。通過集成片上倍增增益寄存器，電子倍增器件 ( EMCCD ) 以低得多的成本實現(xiàn)了增強型或電子轟擊 CCD 典型的單光子檢測靈敏度，并且不會影響傳統(tǒng) CCD 架構(gòu)的量子效率和分辨率特性。
活細胞成像對細胞顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的要求
針對活細胞成像應(yīng)用的顯微鏡必須配備由堅固的復(fù)合材料或鋁制成的高質(zhì)量框架，并且應(yīng)該通過牢固地安裝在無振動平臺上來穩(wěn)定。外部光學(xué)表面以及組件外殼（聚光鏡、燈箱、物鏡轉(zhuǎn)盤等）應(yīng)保持清潔狀態(tài)，顯微鏡周圍的環(huán)境應(yīng)無塵且相對濕度較低?；罴毎上癯掷m(xù)需要的常規(guī)程序之一是使用科勒照明原理確保顯微鏡光學(xué)路徑和光闌對齊。
活細胞成像較關(guān)鍵的方面可能是實現(xiàn)較佳放大倍率，同時在實驗過程中平衡信號強度（有利于低倍率）、分辨率（有利于更高倍率）和細胞活力。研究人員使用時注意用盡可能少的透鏡元件將光學(xué)放大倍率與探測器的像素大小相匹配。具有多種中間放大倍數(shù)的光耦合器可在市場上買到，以滿足光限制和高分辨率應(yīng)用的特定物鏡要求（放大倍率和數(shù)值孔徑）。在選擇顯微鏡物鏡放大倍率時，應(yīng)嚴格考慮奈奎斯特分辨率標(biāo)準。
活細胞成像常用的標(biāo)準顯微鏡物鏡是 10x 和 40x（干），以及 40x、60x 和 100x 油浸或水浸版本。經(jīng)濟的干式低倍率鏡頭主要用于樣品的初步掃描以定位感興趣的區(qū)域，并且不需要高光學(xué)校正因子。而浸沒透鏡應(yīng)具有高數(shù)值孔徑（油為 1.3 至 1.45，水為 1.2）和高透光效率。由于圖像通常聚集在視場中心附近，因此高度校正以產(chǎn)生平坦視場的物鏡通常不會提供可檢測的好處，并且與校正較少的物鏡相比，成本明顯更高且光效更低。
冷卻單色 sCMOS 和 CCD 相機是大多數(shù)涉及培養(yǎng)中活細胞的成像應(yīng)用的適宜選擇，無論是落射熒光還是具有對比度增強（DIC 和相差）的透射光是主要采集模式。在選擇相機時，要考慮的重要參數(shù)包括量子效率、噪聲水平（暗電流和讀數(shù)）、像素大?。ㄒ约跋嚓P(guān)的全阱容量）和掃描頻率。為了盡量減少撞擊樣品的激發(fā)光水平，相機應(yīng)盡可能靈敏，這通常意味著高量子效率、低噪聲、大像素尺寸和慢掃描速率。
慢掃描 CCD 相機的幀速率通常受到限制，除非樣品具有極亮的熒光，否則當(dāng)曝光時間短時信噪比會差。這限制了這些相機系統(tǒng)在高速成像應(yīng)用中的使用（范圍高達每秒 30 幀），并阻礙了對樣本進行聚焦的嘗試。在定位合適的標(biāo)本和聚焦相機時，應(yīng)盡量避免光漂白和光毒性，這些偽影會影響細胞活力和亮度。在這方面，應(yīng)選擇具有無快門、幀傳輸?shù)腅MCCD裝置 或行間 CCD 傳感器的相機，這些傳感器除了能夠提供慢速掃描數(shù)字信號外，還能夠以視頻速率提供連續(xù)的圖像流。
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