標簽：單克隆抗體技術 生物反應器
抗體是具有免疫活性的糖蛋白結構。當它們識別細菌、病毒或腫瘤細胞等異物時，它們能夠識別或誘導中和免疫反應。免疫球蛋白由 B 淋巴細胞響應抗原的存在而產生和分泌。目前，單克隆抗體技術(mAb) 主要是從這些細胞的培養(yǎng)中產生的。其需求的培養(yǎng)條件如下：
培養(yǎng)基的要求
哺乳動物細胞的培養(yǎng)基必須含有復雜的成分，從氨基酸到微量元素。為了滿足細胞對這些營養(yǎng)素的需求，培養(yǎng)基在其成分中使用血清，然而，由于缺陷朊病毒引起的疾病的出現，例如牛海綿狀腦炎 (BSE)，因此有很大的動機去除任何動物成分培養(yǎng)基成分，特別是如果培養(yǎng)基用于生物制藥產品的工業(yè)生產。這導致了不含任何動物成分的培養(yǎng)基的出現，包括用于 CHO 和 NS0 的明確培養(yǎng)基，這是 mAb 生產中常用的兩種細胞類型。由于開發(fā)合適的培養(yǎng)基成本較高好。所以，許多公司喜歡開發(fā)自己的生產培養(yǎng)基來維持生產批次之間的成分，并為將要使用的特定細胞類型開發(fā)合適的培養(yǎng)基成分，并實現對生產的更大控制。除此之外，開發(fā)滿足高純度產品要求的下游工藝和驗證最終產品質量的測試會提高基于單克隆抗體的藥物的總體生產成本。盡管開發(fā)培養(yǎng)基很復雜，但在這一領域已經取得了很大進展，允許在合適的條件下進行更大的細胞生長并增加細胞保存時間，以促進目標分子的生長和生產 。
培養(yǎng)條件的要求
細胞生長條件可以直接影響感興趣分子的細胞生長和生產水平。通常，用于 mAb 生產的哺乳動物細胞培養(yǎng)條件非常明確：37 °C、pH 7.15 和30–60% 的溶解 O 2 (OD) 水平。二氧化碳2監(jiān)測水平以模擬 31 至 54 mmHg 之間的生理標準。然而，細胞條件的變化已顯示出改變細胞代謝向細胞生長或分子產生的巨大潛力，這可用于增加 mAb 的產生。生物過程可以設計為分兩個階段進行。首先，優(yōu)化細胞生長以達到一定的細胞密度。一旦達到這個密度，第二階段就開始了，生物反應器的條件發(fā)生了變化，因此細胞繼續(xù)以維持速率生長，并將新陳代謝引導向單克隆抗體的產生。一些 CHO 細胞株和雜交瘤細胞對溫度和 pH 值的變化很敏感。當溫度和 pH 值低于通常使用的值時，值分別在 30 到 35°C 和 6.7-7.0 之間，細胞生長代謝減少，比產量增加。生長代謝減少還有助于降低某些對細胞培養(yǎng)物有毒的代謝化合物的產生，從而提高細胞活力，從而花費更多時間產生感興趣的分子。監(jiān)測細胞培養(yǎng)生長階段以控制培養(yǎng)變化的一個好方法是觀察 DO 和 pCO2 個水平，也可以對其進行調整，以最大限度地提高 mAb 等蛋白質的產量 。
單克隆抗體生產工藝
用于 mAb 生產的細胞培養(yǎng)可以遵循三種不同類型的過程。其中較簡單的是批量生產，它由一個封閉系統組成，在該系統中，生物反應器被滅菌并用含有細胞生長和產品制造所需的所有營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基制備，然后接種細胞。沒有新鮮培養(yǎng)基的進料系統或用過的培養(yǎng)基的退出。隨著過程的進行，營養(yǎng)濃度降低并產生廢物代謝物，從而降低細胞活力。
在此過程之中過程由于反應器內的環(huán)境很快變得不利于細胞生長，同時廢物濃度增加。初始營養(yǎng)濃度和代謝廢物產生等培養(yǎng)因素直接決定了細胞在浴培養(yǎng)中可以達到的MAX濃度。通常，這種培養(yǎng)方式的MAX密度為 1-2 × 106細胞/mL，然后細胞活力迅速下降。生產過程持續(xù) 4-7 天，當生產力達到一定的關注濃度時。收集上清液并通過下游工藝回收產品。每批完成所需的時間還取決于生產動力學。如果生產依賴于生長（生產與細胞生長同時發(fā)生），則可以在細胞達到穩(wěn)定期后立即停止批處理。
與分批相比，使用的第二種生產過程是連續(xù)發(fā)酵。有兩種類型的連續(xù)生產：恒化器培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)。關于恒化器培養(yǎng)，將新鮮培養(yǎng)基添加到生物反應器中，并以恒定流速將發(fā)酵培養(yǎng)基與細胞一起去除，以使培養(yǎng)體積保持不變。流速（稀釋率）控制細胞生長，當這兩個變量相等時，生物反應器達到平衡——細胞濃度、營養(yǎng)濃度和產品濃度保持恒定。在這種情況下，培養(yǎng)物可以保持平衡數月，達到 10-30 × 10 6 個細胞/mL 。
為了避免活細胞損失以及細胞代謝副產物的不斷流出，許多制造廠開發(fā)了細胞回收系統，因此開發(fā)了灌注培養(yǎng)方法，將細胞保存在生物反應器內。連續(xù)發(fā)酵的缺點是會使用大量昂貴的培養(yǎng)基和難以回收的產品，產品過度稀釋。為了解決產品稀釋問題，一些生產制造廠有超濾系統，將產品保留在生物反應器內 。此類過程的另一個障礙是，為穩(wěn)定的工業(yè)生產工廠建立培養(yǎng)條件可能需要數月時間。為此，所使用的菌株必須非常穩(wěn)定，并清楚地闡明其生理方面，例如生長速率、生產力和對某些壓力條件的反應。在穩(wěn)定的生產工廠落戶之前，多次嘗試的情況并不鮮見，但是一旦落戶，這種生產過程可以帶來許多優(yōu)勢，因為它可以在更小體積的生物反應器中運行，因此具有更大的生產靈活性。
第三種生產單克隆抗體的工藝是迄今為止工業(yè)規(guī)模使用較多的工藝，即分批補料工藝。在這個過程中，細胞密度達到 8-12 × 10 6 個細胞/mL，并且通過在一定的時間間隔內控制營養(yǎng)添加來提高生物反應器中的細胞活力。生產過程可能需要 12-20 天。通常，初始培養(yǎng)中使用的相同培養(yǎng)基也用于飼喂，但濃度更高?？梢栽O計補料溶液組合物，通過分析和識別消耗更多的培養(yǎng)基營養(yǎng)物，根據細胞在不同培養(yǎng)階段的代謝狀態(tài)來供應細胞。此外，可以修改用于喂養(yǎng)的培養(yǎng)基以促進細胞生長或刺激分子產生，因為不同的成分可能會改變細胞的行為，從而改變新陳代謝以達到不同的目的。進料溶液還可以設計為最大限度地減少過量代謝物的產生，這些代謝物會在過量時引起細胞應激。
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