抗原修復(fù)技術(shù)主要用于增強(qiáng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)中的信號(hào)。下面介紹一下抗原修復(fù)方法和修復(fù)技巧。
一、抗原修復(fù)方法
固定是在免疫組織化學(xué)過(guò)程中進(jìn)行的一個(gè)關(guān)鍵步驟，以保持組織形態(tài)。然而，這種方法也可能對(duì)免疫組織化學(xué)產(chǎn)生不利影響，因?yàn)樗?jīng)常改變蛋白質(zhì)生物化學(xué)并掩蓋感興趣蛋白質(zhì)的表位。因此，一抗無(wú)法與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度低。這種掩蔽效應(yīng)可能是由表位中氨基酸的交聯(lián)或無(wú)關(guān)但存在于表位附近的肽的交聯(lián)引起的。這會(huì)改變抗原的構(gòu)象或靜電荷。在抗原修復(fù)過(guò)程中，這種掩蔽被逆轉(zhuǎn)，從而可能發(fā)生抗原與表位之間的結(jié)合。
二、抗原修復(fù)技巧
抗原修復(fù)基于幾個(gè)變量，例如目標(biāo)抗原、抗體、組織類(lèi)型以及固定的持續(xù)時(shí)間和方法。通常，多克隆抗體在不使用抗原修復(fù)方法的情況下可能會(huì)更好地工作，因?yàn)樗鼈冏R(shí)別多個(gè)表位。然而，單克隆抗體依賴于對(duì)單個(gè)特定表位的識(shí)別才能發(fā)揮作用。正在使用多種策略來(lái)檢索抗原。有些方法就像改變抗體稀釋劑中陽(yáng)離子的pH值或濃度一樣簡(jiǎn)單，這也可以改變抗體及其表位的親和力。
在表位被部分掩蓋的情況下，可以在嘗試其他抗原修復(fù)方法之前增加一抗孵育。然而，必須首先優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度和濃度的這些參數(shù)。目前使用兩種主要方法來(lái)檢索抗原。
1.蛋白酶誘導(dǎo)表位修復(fù) (PIER)
在這種方法中，不同的酶用于恢復(fù)抗原和表位之間的結(jié)合。這個(gè)過(guò)程應(yīng)該通過(guò)切割形成表位的肽來(lái)工作。然而，PIER成功率低，在此過(guò)程中可能會(huì)破壞組織形態(tài)和抗原。
2.熱誘導(dǎo)表位修復(fù) (HIER)
在該技術(shù)中，熱量用于逆轉(zhuǎn)交聯(lián)并恢復(fù)原始和三級(jí)表位結(jié)構(gòu)。該方法針對(duì)每種組織、固定方法和感興趣的抗原進(jìn)行了優(yōu)化。
在這種情況下，使用微波爐、壓力鍋、蒸鍋、高壓釜或水浴提供熱量。這種方法比PIER方法有更高的成功率。在此過(guò)程中，樣品在更換緩沖液之前會(huì)短時(shí)間加熱。
某些實(shí)驗(yàn)室使用溫度設(shè)置為 60°C 的水浴，然后將載玻片在修復(fù)溶液中孵育過(guò)夜。
如果切片在高溫下從載玻片上脫落（可能用于骨骼、軟骨和皮膚），此類(lèi)技術(shù)可能很有用。在這種方法中，載玻片在加熱之前先冷卻。HIER 受時(shí)間、溫度、緩沖液和 pH 值的影響，該方案是通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定的。
三、抗原修復(fù)的局限性是什么？
抗原修復(fù)過(guò)程通常需要將樣品牢固地粘附在載玻片上。此外，這種方法對(duì)于某些樣品通常過(guò)于苛刻，例如低溫恒溫器組織和酒精固定組織。還需要優(yōu)化每個(gè)樣品的溫度、時(shí)間和 pH 值；在決定每個(gè)樣品的最佳條件之前，需要測(cè)試這些條件。
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