熒光素酶檢測(cè)時(shí)的注意事項(xiàng)

標(biāo)簽：熒光素 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 熒光強(qiáng)度   熒光檢測(cè) 啟動(dòng)子 

  螢火蟲(chóng)可以在螢光素酶的存在下將螢光素轉(zhuǎn)化為氧化螢光素以發(fā)光。利用熒光素酶的較常見(jiàn)的科學(xué)測(cè)定是報(bào)告基因測(cè)定，其中可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自熒光素酶反應(yīng)的光信號(hào)來(lái)跟蹤轉(zhuǎn)錄激活或抑制。建議使用雙熒光素酶系統(tǒng)，其中發(fā)生二次生物發(fā)光反應(yīng)。第二個(gè)信號(hào)由另一個(gè)分子發(fā)出。最常見(jiàn)的是由也可以生物發(fā)光的海腎基因編碼（一些質(zhì)粒已經(jīng)包含海腎和螢光素酶基因，例如 Promega 的 pmirGLO）。這允許您將熒光素酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照并測(cè)量您的相對(duì)轉(zhuǎn)染效率。

熒光素酶檢測(cè)過(guò)程中的注意事項(xiàng)：
1.信號(hào)問(wèn)題：無(wú)信號(hào)或低信號(hào)。
    這可能歸于轉(zhuǎn)染問(wèn)題。我會(huì)先檢查你的質(zhì)粒的質(zhì)量。確保您具有轉(zhuǎn)染質(zhì)量的 DNA正常的小量制備柱通常會(huì)攜帶更多的內(nèi)毒素和鹽，這些內(nèi)毒素和鹽可能會(huì)抑制您的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或?qū)е录?xì)胞死亡。
    有些細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染。建議對(duì)使用的每個(gè)細(xì)胞系，對(duì) DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的量進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。顯然，作為您的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照，使用的海腎質(zhì)粒的量應(yīng)始終保持不變。
2.DNA 量：通常您要評(píng)估對(duì)照質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒，由于添加了實(shí)驗(yàn)序列，這些質(zhì)粒的大小可能不同。即使您將相同量的 DNA 轉(zhuǎn)染到每個(gè)孔中，每個(gè)孔獲得的 DNA 總量也可能不同，因?yàn)槟D(zhuǎn)染的摩爾比不同。
例如：
來(lái)自 2000 bp 質(zhì)粒的 1 µg DNA 是 0.76 pmoles DNA
來(lái)自 3000 bp 質(zhì)粒的 1 µg DNA 是 0.51 pmoles DNA。
較大的質(zhì)粒每克含有較少的 DNA 摩爾數(shù)！因此，您需要轉(zhuǎn)染更大質(zhì)粒的更多 DNA，才能轉(zhuǎn)染與小質(zhì)粒相同數(shù)量的 DNA。為了使轉(zhuǎn)染的 DNA 量標(biāo)準(zhǔn)化，許多人使用“填充"DNA，例如 pUC19 質(zhì)粒（在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有功能）。
例如，要測(cè)試不同數(shù)量的熒光素酶質(zhì)粒但保持總 DNA 相同，您可以執(zhí)行以下操作：

3.時(shí)間：您可能錯(cuò)過(guò)了可視化效果的窗口。細(xì)胞通常在轉(zhuǎn)染后 24 – 48 小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但這在很大程度上取決于細(xì)胞機(jī)器表達(dá)您感興趣的基因所需的時(shí)間?？梢砸?xún)?yōu)化轉(zhuǎn)染后孵育時(shí)間的時(shí)間過(guò)程來(lái)決定檢測(cè)細(xì)胞的合適時(shí)間點(diǎn)。
4.信號(hào)太強(qiáng)：飽和度：雖然高的信號(hào)可能被視為陽(yáng)性，但您還需要確保您處于檢測(cè)和光度計(jì)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，并且不會(huì)使信號(hào)飽和。如果您有較高的值，則您可能使用了過(guò)多的 DNA。
啟動(dòng)子強(qiáng)度：此外，您可能需要更改質(zhì)粒。如果您使用非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，例如 CMV 或 SV40，這也可能會(huì)使您的信號(hào)飽和。某些應(yīng)用（例如，如果您正在測(cè)量 miRNA 阻斷結(jié)合位點(diǎn)的能力）需要較弱的啟動(dòng)子，因?yàn)槟吹降男Ч赡鼙绒D(zhuǎn)錄阻遏元件的效果非常輕微。

重復(fù)之間的差異：
同一實(shí)驗(yàn)的孔之間的差異表現(xiàn)在：
1.移液：孔獲得的液體量的微小變化會(huì)極大地影響轉(zhuǎn)染和熒光素酶測(cè)定的執(zhí)行方式。熒光素酶檢測(cè)對(duì)此較為敏感！建議為您的轉(zhuǎn)染反應(yīng)制作預(yù)混液（即使它只是用于重復(fù)的 3 個(gè)孔）。對(duì)于每個(gè)組合，您應(yīng)該始終至少有 2 次重復(fù)，最好是 3 次。
2.酶標(biāo)板：另一個(gè)問(wèn)題可能是你的酶標(biāo)板。來(lái)自相鄰孔的背景發(fā)光會(huì)干擾您的實(shí)驗(yàn)。建議您在白壁或不透明板中進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。但是，您無(wú)法在白色孔板中看到您的細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兪?白色的！
3.實(shí)驗(yàn)之間的變異（生物變異）
    應(yīng)該重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，以確保您測(cè)量的效果是可重復(fù)的，因此有可能與生物學(xué)相關(guān)。然而，我們注意到細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的能力在很大程度上取決于它們的匯合度，尤其是貼壁細(xì)胞。轉(zhuǎn)染依賴(lài)于細(xì)胞表面接觸，過(guò)度融合的細(xì)胞可能轉(zhuǎn)染效率較低。不要假設(shè)如果您接種相同數(shù)量的細(xì)胞，它們每次都會(huì)以相同的方式沉淀在板的底部！從而致使細(xì)胞結(jié)塊。嚴(yán)重地影響您細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和熒光素酶的檢測(cè)結(jié)果。