蛋白免疫印跡實驗常見問題原因分析匯總?cè)缦拢?/strong>
一、檢測無信號
主要可能由于以下原因?qū)е拢?/strong>
1. 用于檢測的二抗不匹配。解決辦法：需要確定一抗的宿主。
2. 一抗二抗的濃度過低：需要耐心地重新實驗。
3.一抗不識別被檢測物種中的蛋白質(zhì)：可以再檢查以下一抗的特異性。
4.凝膠上上樣的蛋白量太少：凝膠上樣品過少也會導(dǎo)致信號弱，所以適當(dāng)增加樣本量也可以防止此現(xiàn)象發(fā)生。
5.傳輸效率相當(dāng)?shù)?/span>：出現(xiàn)這種情況可以嘗試修改轉(zhuǎn)移程序的操作，確保 PVDF 與甲醇預(yù)孵育。轉(zhuǎn)移后干燥 PVDF 以確保蛋白質(zhì)與疏水膜的結(jié)合。
6.一抗使用次數(shù)過多：億康如果過度稀釋對信號檢測也會有一定的影響，所以盡量使用新稀釋的一抗。
7.阻塞時間過長或洗滌次數(shù)過多：盡量減少阻塞時間和洗滌時間。
8. 檢測試劑盒不起作用：這種情況出現(xiàn)的較少，實驗中注意試劑盒的有效期是否正常，也可使用陽性對照并確保檢測試劑盒正常工作。
9.NaN可能會抑制二抗：盡量避免在稀釋緩沖液中使用NaN。
10.一抗或二抗的孵育時間太短：可適當(dāng)延長孵化時間
11. SDS 上樣緩沖液和樣品裂解液沒有充分混合或者混合不均勻： SDS 上樣緩沖液需要隨用隨配，以保證其新鮮度，另外緩沖液與裂解液可以使用渦旋混合器進行充分混合。
二、無蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景
蛋白免疫印跡常見問題中出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能由于以下幾種情況所導(dǎo)致。
1.可能由于封閉時間過短或封閉緩沖液使用不當(dāng)。大多數(shù)一抗基本不會和白蛋白或酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。如果任何沒有蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景，則封閉步驟可能無法正常工作。
2.一抗或二抗的濃度過高所致：適當(dāng)降低抗體濃度。
3.洗滌不夠充分：可以增加洗滌的次數(shù)。
4.孵化溫度過高：一抗的孵育溫度以4°C左右為宜。
5.轉(zhuǎn)印膜選用不當(dāng)，或者轉(zhuǎn)印膜干燥：一般情況下選用PVDF膜具有較好的轉(zhuǎn)印效果，同時防止膜干燥。
6.較高分子量的高背景也有可能是由于還原試劑、SDS或樣品加熱方式時長不正確。
三、出現(xiàn)白帶或信號迅速減弱
1.一抗或二抗過高：適當(dāng)降低抗體濃度
2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鮮程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。
3.混合后的 ECL 溶液壽命縮短：注意選擇合適的ECL 解決方案。
四、斷帶、特殊條帶出現(xiàn)
凝膠電泳期間使用的電壓過高或緩沖液溫度過高會出現(xiàn)這種情況。
五、出現(xiàn)漫反射帶
1.抗體濃度過高：適當(dāng)降低抗體濃度。
2.凝膠上上樣的蛋白質(zhì)量太高：盡量減少上樣量。
六、出現(xiàn)空白區(qū)域
這種情況多數(shù)是由于轉(zhuǎn)移不均勻所造成。轉(zhuǎn)移時需要確保膜在凝膠上均勻無氣泡。
七、非特異性信號
有的時候高濃度的抗體也導(dǎo)致非特異性信號出現(xiàn)。內(nèi)源性免疫球蛋白，尤其是在組織裂解物中 容易出現(xiàn)信號干擾。可以通過預(yù)先清除內(nèi)源性免疫球蛋白來減少來自內(nèi)源性免疫球蛋白的非特異性信號。
八、條帶模糊或者出現(xiàn)污斑
這多數(shù)由于凝膠平衡時間不足或凝膠與膜接觸不均勻所致。
